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甘薯(南薯88)粗多糖含量硫酸苯酚法检测研究

时间:2018-09-20 16:14作者:admin打印字号:

Determination of Crude polysaccharide from Sweet Potato variety Nanshu 88 by Phenol-Sulfuric Acid Method
Liu Lu,Zhao DaQun,Feng xu,Gou FanCheng,Wang Mei,Ding Xiang,Hou YiLing
  1. Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation (Ministry of Education), College of Life Sciences, China West Normal University, 1# Shida Road, Nanchong, Sichuan province 637009, China; 2. Nanchong Academy of Agricultural Science Research, Nanchong, Sichuan province, 637001, China)
Abstruct:The assay of determination of total sugar content in Nanshu 88 was built. The content of polysaccharide was determined by method of phenol-sulfuric acid.  The results showed that the optimum measure condition was at wavelength of 490nm after 20 min. The precision of the RSD was 0.09%; the stability of RSD was 0.65%, and the average recovery was 98.4%. The average content of Nanshu 88 polysaccharide is 40.27 g/ml using glucose as a standard test. This method provided a stable and reliable technique for the determinatin of total sugar content in Nanshu 88.
Key words : Nanshu 88; Crude polysaccharide; Phenol-Sulfuric Acid Method.
 
甘薯俗称红薯、番薯等,我国大部分地区都以此作为粮食作物,由于其营养价值很高,近年来得到很多人的喜爱。南薯88是四川省南充地区农科所通过晋专7号与美国红作亲本杂交选育而成。1988年四川省农作物品种审定委员会审定,1991年全国农作物品种审定委员会审定。品种登记号为GS05001-l990。长江流域各省作为食用和饲用品种种植。
多糖与蛋白质、核酸共同组成生物体内三大生物分子,而多糖又是机体中的重要组成部分。由于现代医学、细胞生物学及分子生物学快速发展,人们深刻认识到多糖对人体免疫调节的重要性。植物多糖又称植物多聚糖,是由多个单糖通过糖苷键聚合而成具有多羟基醛的大分子物质。植物多糖在医药、农业、食品等领域具有独特的作用[1-3]。在医药方面,一定剂量的活性多糖可以制备疫苗,作为抗肿瘤药物;在农业方面,植物多糖能够很好的改善作物的品质;在食品方面,多糖中的果胶可作为天然的食品添加剂[4]。 植物多糖的提取操作过程繁琐,且植物中的多糖含量极少,这就给实验中增加了许多困难。目前采用的测定多糖含量有很多方法,比如高效液相色谱法、蒽酮硫酸法以及苯酚硫酸法[5,6]。高效液相色谱法有高的分离效率,很好的选择性,以及高的灵敏度,但是仪器相当昂贵且分析成本高;大多选用后两种,因为重现性比高效液相色谱法要好。本研究以南薯88热水浸提后,无水乙醇醇沉后得到南薯88的粗多糖,建立硫酸苯酚法[7]确定测定南薯88多糖的方法,此方法操作简便,重复性高,可靠性强。
一、材料与方法
(一)主要材料与试剂
1. 主要试剂
    南薯88由四川省南充市农业科学研究所,国家甘薯改良中心南充分中心提供;南薯88的醇沉得到的上清粗多糖溶液;葡萄糖;浓硫酸;苯酚;无水乙醇;本实验的药品均为分析纯;
2. 主要实验仪器
    旋转蒸发器购买于上海亚荣生化仪器厂(货号:RE6000A)。电热恒温水浴锅购于广东环凯微生物科技有限公司(货号:18001056)。中兴牌FZ102粉碎机。紫外分光光度计购于上海精科实业有限公司(货号UV-2102)。电子天平购于奥豪斯仪器(上海)有限公司(货号AR 2130)。27mm[MW:7000]透析袋购买于上海凌初环保仪器有限公司(货号MD34-7)。
(二)方法
1. 硫酸苯酚法的原理
多糖能够在浓硫酸的作用下会水解成单糖分子,接着单糖分子会迅速脱水生成糠醛衍生物,而糠醛衍生物与苯酚生成橙黄色化合物[8]。在一定范围内,反应的颜色会随着多糖含量的增加而逐渐加深。
2. 南薯88粗多糖的提取
取晒干南薯88的茎叶,剪成小段烘烤过夜,隔天用粉碎机粉碎后以料液比1:3的比例热水浸提,煮三次,每次六小时,收集滤液后反复浓缩,加4倍无水乙醇沉淀后离心得到上清液的粗多糖。
3. 葡萄糖标准溶液的配制
称取干燥恒重的葡萄糖标准品0.01g置于100ml的容量瓶中,然后加蒸馏水充分溶解至刻度,用玻璃棒混匀,得到的葡萄糖标准溶液浓度为100μg/ml,保存备用[9-12]
4. 苯酚溶液的配制
酚易氧化成淡红色,宜现配现用。称取干燥恒重的苯酚5g置于100ml的容量瓶加蒸馏水溶解定容,就得到浓度为5%苯酚试剂。保存备用。
5. 波长的选择
    精确吸取标准对照品和待测品溶液2 ml于两个试管中,分别加入1 ml 5%的苯酚试剂,混合;再加5ml浓硫酸,迅速振荡混匀,在室温下放置20分钟,在分光光度计上扫描400~600 nm之间的OD值,检测最大的吸收波长。
6. 标准曲线的绘制
    吸取配置好的100 μg/ml的葡萄糖标准品溶液1、2、3、4、5、6、7、8ml于试管中,依次滴加蒸馏水使得最终体积为10ml, 终浓度为10、20、30、40、50、60、70、80 μg/ml,空白对照为10ml水。各取2ml于试管中,分别加入1ml5%的苯酚试剂,混合;再加5ml浓硫酸,迅速振荡混匀,在室温下放置20分钟后在分光光度计下测吸光度。横坐标为葡萄糖的浓度(x,μg/ml),纵坐标为吸光度A,绘制标准曲线[13]
7. 待测品的测定
    取适量的待测品,稀释成体积为2ml。按照2.6中的方法操作,重复测定吸光度值三次。根据回归方程计算,即可得到待测品的多糖含量。
二、结果与分析
(一)最大波长的选择
    在400~600nm的范围内测定吸光度。结果显示,在490nm得到最大的吸光度。
(二)标准曲线与回归方程
    以葡萄糖的浓度(x,μg/ml)为横坐标, 吸光度A为纵坐标,绘制吸光度-葡萄糖质量浓度的关系曲线。线性回归方程为Y=0.015X+0.034,相关系数R2=0.995。结果显示,葡萄糖在0~70μg/ml的范围内很好地符合郎白-比尔定律,其浓度与吸光度具有良好的线性关系,如图1。
葡萄糖标准曲线
                                  图1 葡萄糖标准曲线
                               Fig.1  Glucose standard curve
(三)精密度实验
按照2.6中的方法重复测定同一浓度为70μg/ml的葡萄糖标准品溶液6次,计算结果如图所示,测定结果的相对标准偏差(RSD)为0.08%。结果表明仪器的精确性[14]良好,如表1。
 
 
                         表1 精密度试验结果 (n=6)
                      Tab.1 Result of precision experiment (n=6)
序号 吸光度/A 平均值/ A RSD%
1 1.099    
2 1.101    
3 1.1 1.1 0.09
4 1.101    
5 1.101    
6 1.099    
 
(四)准确度实验
    采用加样回收法,精密吸取待测样品溶液1ml 3份,分别加入不同浓度的葡萄糖标准品1ml,按照2.6中的方法测定吸光度值,计算回收率,结果见表2。
                       表2 回收率试验结果(n=3)
                      Tab.2  Result of recovery experiment (n=3)
样品量/mL 原含量/μg 加标量/μg 测标量/μg 回收率/%
1 50 20 20 100
1 50 30 28 93.3
1 50 40 41.2 102
 
(五)稳定性实验
    精密吸取待测样品0.6ml,加入蒸馏水至2ml,按照2.6中的方法在室温下每隔20min测定一次吸光度值(n=7),连续2h测定粗多糖的稳定性,测得RSD%=1.7%。并且在4小时内无明显变化,表明此方法的稳定性良好。结果见表3。
(六)样品含量的测定
    按照2.6中的方法测定南薯88醇沉上清液的粗多糖中的多糖含量[15],结果见表3。
                            
 
表3  样品中多糖含量(n=3)
                   Tab.2  Content of polysaccharides in sample (n=3)
项目   样品中多糖含量  
测定值(μg/mL) 40.28 40 40.52
平均值(μg/mL)   40.27  
RSD%   0.65  
三、讨论
    近年来,植物多糖受到越来越多的学者关注,但是提取多糖的过程却困难重重,提取出的多糖会含有大分子杂质,影响后续的实验结果[16]。而南薯88是四川省农科院种植的优良品种,具有很好的研究价值。本研究测定南薯88多糖含量采用硫酸苯酚法测定,在波长为490nm,20min后的条件下吸光度值稳定,4h内无明显变化,表明此方法的稳定性以及精密度良好;南薯88多糖含量为40.27μg / ml; 葡萄糖标准曲线浓度在0 - 60μg / ml范围内呈良好的线性关系。实验中对南薯88进行了乙醇沉淀的方法去除了蛋白质和核酸,但是南薯88本身可能还是含有色素等大分子杂质,这些成分也会造成吸光度偏大,使计算出的多糖含量偏高。本文在南薯88中植物多糖测定方面提出了规范性建议,为今后植物多糖检测标准提供了一定的基础。今后,随着科技进步,研究方法的优化,将会有更好的方法测定多糖的含量,并将此应用于实际生产。
 
 
 
参考文献
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