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哲学与人文科学

蔗糖酶对蔗糖转化反应影响的动力学研究

时间:2018-08-05 13:25作者:admin打印字号:

蔗糖酶对蔗糖转化反应影响的动力学研究
谢京  荣华  李巍  戚传松
(北京石油化工学院  北京 102617)
摘    要:研究蔗糖酶催化蔗糖转化反应的动力学特性,计算了自制蔗糖酶的比活性,根据Hanes-Woolf作图法配合计算机数据拟合方法改进了蔗糖酶米氏常数测定的方法,实验测得的最大速率rm和米氏常数Km都与文献值相符合。通过这种改进的蔗糖米氏常数测定方法,制药工程等专业的学生能够把物理化学的理论与本专业知识相结合,更好地理解酶催化反应动力学,对于制药工程等专业的实验教学具有积极意义。
关  键  词:蔗糖酶;转化;旋光度;米氏常数;动力学研究
【中图分类号】O643    【文献标志码】A
 
Kinetic study on the conversion of sucrose with the sucrase
Xie Jing , Rong Hua , Li Wei,Qi Chuansong*
(College of Chemical Engineering, Beijing Institute of
Petro-Chemical Technology, Beijing 102617, China)
Abstract  Studied the dynamics characteristics of the conversion of sucrose with the sucrase, calculated the specific activity of homemade sucrase. According to the Hanes-Woolf mapping method cooperate with data fitting method with computer have improved the determination method of the sucrase Michaelis constant , the maximum rate(rm) and Michaelis constant(Km)measured in the experiment are consistent with the literature value. Reformatted the traditional method that catalyzed with hydrochloric acid , it will make the students who major in pharmaceutical major and other related majors are able to combination the theory of physical chemistry together with our professional knowledge, this will be positive significance for the pharmaceutical engineering and other professional experiment teaching.

Key words  Sucrase; conversion;specific rotation;Michaelis constant;kinetic study

 1 实验原理
蔗糖水解反应的动力学实验是化学化工类专业的必修实验,其理论已相对成熟。蔗糖水解反应式为[1,2]
   
   目前高校学生实验中所采用的催化剂大部分为无机酸(如盐酸),尽管得出的数据重现性以及结论等都比较不错,但考虑到催化剂为较浓的盐酸,容易挥发,腐蚀性强,不仅对实验仪器造成损耗,而且对环境也会造成污染[3]。 酶是由生物细胞合成的一种蛋白质[4],不仅催化效率高[5-7],而且绿色环保。更重要的一点是:酶催化反应是动力学中的重要内容之一,研究蔗糖酶催化的蔗糖水解反应,一方面能让学生获得普通酸碱催化剂催化蔗糖水解反应所能获得的基本动力学数据,如速率常数,另一方面获得酶催化反应的相关数据,扩充了实验内容。
根据酶催化反应机理[5,6],蔗糖酶(E)与底物蔗糖(S)先形成中间化合物(ES),然后中间化合物再进一步分解为产物葡萄糖(G)和果糖(F),并释放出酶(E)。机理如下[7]
      
        酶促反应速率在反应温度和酶的总浓度确定时可以表示为米氏方程
                        (1)
其中为米氏常数,为最大速率。
采用旋光度法测定反应体系中蔗糖浓度时,反应体系的旋光度与蔗糖浓度的关系为
                      (2)
其中为反应t时刻反应体系的旋光度,为反应初始时刻反应体系的旋光度,为完全反应时反应体系的旋光度,为蔗糖的初始浓度。
令,则,代入(1)可得
                     (3)
积分可得         
           (4)
从原理上说,按上式直接拟合实验测定的数据就可以得到酶促反应参数Kmrm。但由于实验数据的不完备性、波动性以及酶制剂的质量问题,关系式中的拟合参数可能无法与上式中相关项的定义一一对应。因此,把实验测定的 关系表达为如下的普遍形式:
            (5)
经过数据拟合,可以得到拟合参数A、B,将A、B代入(1)式,可以得到蔗糖初始浓度为时的初始反应速率为:
                       (6)
  实验时,配制一系列不同初始浓度的蔗糖溶液,并测得其和。在相同实验温度和酶浓度条件下,分别测定每个溶液的反应时间t和旋光度数据,并计算出值。拟合 关系得到拟合参数A、B,并计算每个溶液的初始反应速率r0,由此得到一系列Cs0-r0数据,代入米氏方程中,根据Hanes-Woolf作图法[8,9],米氏方程(1)可变形为
                    (7)
Cs0/r0Cs0作图得一直线,由直线斜率、截距可求得米氏常数Km 和最大速率值。
2实验
2.1实验仪器与试剂
CL-2恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司生产);FX-0电热鼓风干燥箱(上海树立仪器仪表有限公司生产);WZZ-3自动旋光仪(上海物理光学仪器厂生产);无菌针管(江西洪达医疗器械集团有限公司生产);501超级恒温器(上海实验仪器厂生产);台秤;秒表;以及所需的常用仪器。
蔗糖,分析纯,广州化学试剂厂;安琪活性鲜酵母,安琪酵母股份有限公司生产。
2.2实验步骤及数据处理
2.2.1蔗糖酶的制取及比活性的测定
在50mL锥形瓶中加入鲜酵母20g,乙酸钠1.6g,搅拌15到20min后使块团溶化,加入3mL甲苯,用软木塞将瓶口塞住,搅拌10min,放入37℃恒温箱中保温60h。取出后加入3.2mL 4 mol·L-1乙酸和10mL水,调pH为4.5左右。混合物放入3000r/min的离心机中离心十分钟,使混合物形成三层,将中层移出,注入试管中,即为粗制酶液[10,11]
取6g蔗糖加水溶解至100mL,测定其旋光度。在37℃的条件下分别加入蔗糖酶5mL、4 mL、3 mL、2 mL、1mL,反应5min测定体系旋光度值,用公式[12]
            
求出葡萄糖浓度x(mol·L-1),由此计算生成葡萄糖的质量m,利用公式:
比活性=葡萄糖质量m/酶的体积V      
求出酶的比活性平均值约为212.0 mg/mL。
2.2.2米氏常数测定方法改进
配制0.6的蔗糖溶液,分别用蒸馏水稀释,配制0.04—0.3 mol·L-1的蔗糖溶液于50mL容量瓶中,分别在37℃下恒温10min后测定各溶液的初始旋光度,将浓度与得到的旋光度列表并作图,然后拟合得到初始浓度与旋光度的拟合方程为
            (8)
将反应初始时的蔗糖浓度代入此式,可通过计算得到反应初始时的旋光度′。
      用葡萄糖和果糖按摩尔比为1:1配制0.04—0.3 mol·L-1的蔗糖水解最终模拟产物,分别在37℃下恒温10min后测定各体系终止旋光度;将浓度与得到的旋光度列表并作图,然后拟合得到反应完全后浓度与最终旋光度的拟合方程为
                  (9)
将反应完全时的葡萄糖和果糖(1:1)浓度代入此式,可通过计算得到反应完全时的旋光度′。
    分别取0.6 mol·L-1的蔗糖25mL、12.5mL、10mL、7mL、5mL和4mL溶液于50mL容量瓶中,再加入10mL、pH=4.6的缓冲溶液,加入10mL自制粗蔗糖酶,再稀释至刻度线,得到蔗糖浓度为0.3—0.048 mol·L-1的蔗糖酶催化反应溶液;移入带夹套旋光管,在37℃恒温条件下测定不同时刻t时的溶液旋光度。
把根据公式(8)、(9)求得的′、′值代入公式,求出不同时刻的值。以为横坐标,t为纵坐标作图,用Origin软件按公式(5)作非线性拟合,得到拟合参数A、B 值,列于表1。图1是以自制蔗糖酶催化0.3 mol·L-1的蔗糖溶液为例绘制的曲线,由公式(5)得到A、B值分别为1566.804和838.347,填于表1,按同样方法作图计算可得到不同蔗糖初始浓度Cs0对应的A、B值,列于表1。

图1 酶催化的蔗糖溶液的曲线
按公式(6)计算每个Cs0对应的初始反应速率r0值,填于下表1。
表1  不同初始浓度蔗糖溶液的初始反应速率及拟合参数
          
0.30 1566.804  838.347 1.247   2405.15
0.15 702.290   647.778 1.111   1350.07
0.12 533.378   517.080 1.142   1050.46
0.084 513.040   445.910 0.876   958.95
0.06 224.477   429.800 0.917   654.287
0.048 210.381   316.490 0.911   526.87
据(7)式,以表1数据作Cs0/r0Cs0曲线得图2。
  
图2 Hanes-Woolf作图法计算米氏常数
分别由斜率和截距得最大速率和自制蔗糖酶的米氏常数分别为:   
 ,
 =0.032,与文献值相符[13 。
3 结论
本实验制备的蔗糖酶催化蔗糖转化反应,测得的自制蔗糖酶比活性重现性比较好,符合酶的比活性不随酶量变化而变化的特性。
本实验采用成熟的物理化学实验技术,实验原理清晰,方法简单、操作方便,配合计算机数据拟合方法,测得的实验结果可靠性高。针对制药工程等专业的需要,改革了传统化学化工类专业蔗糖转化反应实验采用盐酸作催化剂的方法,通过改进的蔗糖酶米氏常数测定方法,使得制药工程等专业的学生能够把物理化学的理论与本专业知识相结合,更好的理解动力学中的酶催化反应,适合作为制药工程等专业的综合性实验,有助于培养工程应用型人才,对制药工程等专业的实验教学改进有重要意义。

 
参考文献:
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